食品志贺氏菌检验

技术概述

志贺氏菌是一种重要的食源性致病菌，属于肠杆菌科志贺氏菌属，是引起细菌性痢疾的主要病原体。食品志贺氏菌检验是指通过科学、规范的检测方法，对各类食品中是否存在志贺氏菌进行定性或定量分析的技术过程。该检验技术对于保障食品安全、预防食源性疾病传播具有重要的公共卫生意义。

志贺氏菌为革兰氏阴性杆菌，无芽孢、无荚膜、无鞭毛，不能运动。根据其生化反应和抗原特性的不同，志贺氏菌可分为四个群：A群痢疾志贺氏菌、B群福氏志贺氏菌、C群鲍氏志贺氏菌和D群宋内氏志贺氏菌。其中，福氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌在我国较为常见，是食品卫生检验的重点关注对象。

食品志贺氏菌检验技术经过多年发展，已形成较为完善的标准体系。目前，我国主要采用国家标准GB 4789.5-2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》作为检测依据。该标准规定了食品中志贺氏菌的检验方法和操作规程，包括样品处理、增菌培养、分离鉴定等关键环节，确保检测结果的准确性和可靠性。

志贺氏菌在外界环境中的存活能力相对较弱，对热敏感，60℃加热10分钟即可被杀灭。但在适宜条件下，如在污染的食品中，仍可存活一定时间并具有致病性。人体感染志贺氏菌后，潜伏期一般为1-3天，主要症状包括腹泻、腹痛、发热、里急后重等，严重者可出现黏液血便，对婴幼儿、老年人和免疫力低下人群的危害更为严重。

检测样品

食品志贺氏菌检验适用于多种类型的食品样品，涵盖了日常生活和食品工业中常见的各类食品。不同类型的食品样品在检测过程中需要采用不同的前处理方法，以确保检测结果的准确性。以下是常见的检测样品类型：

• 肉与肉制品：包括鲜肉类、冷冻肉类、腌制肉类、香肠、肉罐头等各类肉制品。肉类食品富含蛋白质和水分，是志贺氏菌生长繁殖的良好基质，尤其是不当储存或加工过程中受到粪便污染的肉类产品。
• 乳与乳制品：包括鲜乳、巴氏杀菌乳、奶粉、酸奶、奶酪等。乳制品营养丰富，一旦受到志贺氏菌污染，细菌可迅速繁殖，造成食品安全隐患。
• 蛋与蛋制品：包括鲜蛋、蛋粉、液蛋、皮蛋等。蛋壳表面易受到粪便污染，若处理不当可能导致志贺氏菌进入食品链。
• 水产品：包括鱼类、虾类、贝类等鲜活水产品及其加工制品。水产品生长的水域若受到污染，极易携带志贺氏菌等致病菌。
• 果蔬及其制品：包括新鲜水果、蔬菜、水果罐头、蔬菜罐头、果汁等。生食蔬菜和水果若清洗不彻底或使用受污染的水源灌溉，可能携带志贺氏菌。
• 冷冻饮品：包括冰淇淋、雪糕、冰棍等。此类食品若原料受污染或生产过程中卫生控制不当，可能导致志贺氏菌污染。
• 即食食品：包括盒饭、沙拉、凉拌菜等不需要进一步加热处理即可食用的食品。此类食品由于不再经过加热杀菌，一旦受到志贺氏菌污染，食品安全风险较高。
• 饮用水及饮料：包括瓶装水、桶装水、果汁饮料、碳酸饮料等。水源若受到污水污染，可能携带志贺氏菌等肠道致病菌。

除了食品样品外，食品志贺氏菌检验还可应用于食品生产环境样品的检测，如生产设备表面、工器具表面、操作人员手部、包装材料等，以评估食品生产环境的卫生状况，排查可能的污染来源。

检测项目

食品志贺氏菌检验的检测项目主要包括志贺氏菌的定性检测和定量检测两个方面。根据不同的检测目的和客户需求，可选择相应的检测项目。以下是主要的检测项目内容：

• 志贺氏菌定性检测：这是最常见的检测项目，用于判定食品样品中是否存在志贺氏菌。检测结果以"检出"或"未检出"表示，并注明检样量。定性检测是食品安全监管和生产企业质量控制的基本要求。
• 志贺氏菌菌型鉴定：在检出志贺氏菌的基础上，可进一步进行菌型鉴定，确定分离菌株属于哪个血清群和血清型。常见的鉴定包括A群痢疾志贺氏菌、B群福氏志贺氏菌、C群鲍氏志贺氏菌和D群宋内氏志贺氏菌的区分，以及各群内不同血清型的确定。
• 志贺氏菌定量检测：虽然志贺氏菌的感染剂量较低，定量检测不如定性检测常用，但在某些特定情况下，如食品安全事故调查、科学研究等，可能需要对志贺氏菌进行定量分析，确定样品中志贺氏菌的含量。
• 志贺氏菌毒力因子检测：通过分子生物学方法检测志贺氏菌的毒力相关基因，如侵袭蛋白基因、志贺毒素基因等，评估分离菌株的致病能力。此项检测主要用于科研和流行病学调查。
• 药物敏感性试验：对分离的志贺氏菌菌株进行抗生素敏感性测试，了解其对各类抗生素的敏感性，为临床治疗提供参考依据，同时也用于监测耐药菌株的流行趋势。

在实际检测工作中，检测项目的选择应根据检测目的、样品类型和相关法规标准的要求综合确定。对于日常食品安全监测，定性检测通常已能满足要求；而在食源性疾病暴发调查中，菌型鉴定和药物敏感性试验则具有重要意义。

检测方法

食品志贺氏菌检验采用的方法主要包括传统培养方法和快速检测方法两大类。传统培养方法以其准确性高、结果可靠的特点，仍是目前法定检测的主要方法。快速检测方法则以其检测周期短、效率高的优势，在越来越多的应用场景中得到采用。

传统培养方法：

传统培养方法依据国家标准GB 4789.5-2012进行，主要包括以下步骤：

• 样品制备：称取适量样品，加入增菌液中均质，制备成1:10的样品稀释液。对于固体样品，需先进行均质处理；液体样品可直接量取。
• 增菌培养：将样品接种至志贺氏菌增菌液（如GN增菌液）中，在36℃条件下培养6-18小时。增菌培养可使样品中少量的志贺氏菌繁殖到可检测的水平，同时抑制部分杂菌的生长。
• 分离培养：将增菌后的培养物划线接种于选择性分离培养基，如XLD琼脂、HE琼脂、麦康凯琼脂等，在36℃条件下培养18-24小时。观察平板上可疑菌落的形态特征，志贺氏菌在XLD琼脂上通常呈红色菌落，不产硫化氢；在麦康凯琼脂上呈无色透明或半透明菌落。
• 初步生化鉴定：挑取可疑菌落进行初步生化试验，如三糖铁琼脂试验、葡萄糖铵试验等。志贺氏菌在三糖铁琼脂上表现为斜面红色、底层黄色，不产气、不产硫化氢。
• 生化确认试验：对初步生化试验符合的菌株，进一步进行生化确认试验，包括乳糖发酵、甘露醇发酵、靛基质试验、鸟氨酸脱羧酶试验、西蒙氏柠檬酸盐试验等。根据生化反应结果进行初步判定。
• 血清学鉴定：对生化鉴定符合志贺氏菌特征的菌株，进行血清学凝集试验，确定其血清群和血清型。使用志贺氏菌四种多价血清和各群单价血清进行玻片凝集试验。

快速检测方法：

随着检测技术的发展，多种快速检测方法已应用于志贺氏菌的检测：

• PCR检测方法：利用聚合酶链式反应技术，检测志贺氏菌特异性基因片段。该方法具有灵敏度高、特异性强、检测周期短等优点，可在增菌后数小时内得到结果。常见的检测靶基因包括侵袭蛋白基因等。
• 实时荧光PCR方法：在常规PCR基础上引入荧光探针技术，可实时监测扩增过程，实现定性或定量检测。该方法灵敏度更高，污染风险更小，适合大批量样品的检测。
• 酶联免疫吸附试验（ELISA）：利用抗原抗体特异性结合的原理，检测志贺氏菌或其特异性抗原。该方法操作简便，适合自动化检测，但灵敏度相对较低。
• 胶体金免疫层析法：将特异性抗体标记在胶体金上，制成快速检测试纸条，可在较短时间内得到结果。该方法操作简单、无需特殊仪器设备，适合现场快速筛查。
• ATP生物发光法：通过检测样品中的ATP含量间接反映微生物污染状况。该方法检测速度极快，但不能特异性检测志贺氏菌，通常用于卫生状况的快速评估。
• 基因芯片技术：将多种病原微生物的特异性探针固定在芯片上，可同时检测多种致病菌，适合于食品安全风险的全面筛查。

在实际应用中，传统培养方法仍是仲裁方法，快速检测方法通常作为初筛手段使用。若快速检测结果为阳性，仍需通过传统培养方法进行确认。检测机构应根据检测目的、时限要求和客户需求，合理选择检测方法。

检测仪器

食品志贺氏菌检验涉及多种仪器设备，不同的检测方法所需的仪器设备也有所不同。以下是检验过程中常用的主要仪器设备：

• 恒温培养箱：用于样品增菌培养和分离培养，常用的培养温度为36℃。培养箱应具有良好的温度稳定性和均匀性，温度波动范围通常要求在±1℃以内。
• 高压蒸汽灭菌器：用于培养基、试剂和实验器材的灭菌处理。常用的灭菌条件为121℃，15-20分钟。灭菌器应定期进行性能验证，确保灭菌效果。
• 生物安全柜：为检验操作提供局部无菌环境，同时保护操作人员安全。志贺氏菌属于生物危害等级II级微生物，相关操作应在II级生物安全柜中进行。
• 均质器：用于样品的均质处理，使样品中的微生物充分释放到稀释液中。常用的均质器包括拍击式均质器和旋转式均质器。
• 离心机：用于样品处理过程中菌体的富集和分离。根据不同的处理需求，可选择低速离心机和高速离心机。
• 显微镜：用于观察细菌形态和染色特性。志贺氏菌为革兰氏阴性杆菌，显微镜检查是形态学鉴定的重要手段。
• PCR仪：用于PCR扩增反应，是分子生物学检测方法的核心设备。实时荧光PCR仪则可实现扩增过程的实时监测。
• 电泳仪和凝胶成像系统：用于PCR扩增产物的检测和分析。常规PCR产物需要通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
• 酶标仪：用于ELISA检测中吸光度的测定，是免疫学检测方法的重要设备。
• 自动生化鉴定系统：可自动完成细菌的生化鉴定，提高检测效率和准确性。常见的自动生化鉴定系统可同时完成多项生化指标的检测。
• 微生物菌落计数仪：用于平板菌落的自动计数和分析，可提高工作效率，减少人为误差。
• 超低温冰箱：用于菌株和试剂的长期保存，通常需要-70℃或更低的保存温度。

上述仪器设备应定期进行校准和维护，确保其性能满足检测要求。同时，检测机构应建立完善的设备管理制度，包括设备台账、使用记录、维护保养记录、期间核查等，以保障检测工作的质量。

应用领域

食品志贺氏菌检验在多个领域具有重要的应用价值，是保障食品安全、防控食源性疾病的重要技术手段。以下是主要的应用领域：

• 食品安全监管：各级食品安全监管部门将志贺氏菌列为食品安全的重点监测项目，定期对市场流通食品进行抽检，及时发现和处理不合格食品，保障消费者的食品安全。
• 食品生产企业质量控制：食品生产企业在原料验收、生产过程控制和成品出厂检验中，需要对志贺氏菌进行检测，确保产品符合国家食品安全标准，保障产品质量。
• 餐饮服务行业卫生管理：餐饮服务单位需要对食品原料、加工环境和成品进行志贺氏菌监测，评估食品安全风险，预防食源性疾病的发生。
• 食品进出口检验检疫：进出口食品需要经过检验检疫部门的检测，志贺氏菌是重要的检测项目之一。检测合格后方可通关放行，不合格产品需进行退运、销毁等处理。
• 食源性疾病调查：在细菌性痢疾等食源性疾病暴发调查中，需要对可疑食品进行志贺氏菌检测，并通过分子分型技术追踪传染源和传播途径，为疾病防控提供科学依据。
• 水源卫生监测：饮用水和娱乐用水需要进行志贺氏菌等肠道致病菌的监测，防止水源性疾病的传播。
• 科研与教学：志贺氏菌检验技术是食品科学、预防医学、微生物学等专业的重要教学内容，同时也是相关科研工作的重要技术手段。
• 第三方检测服务：独立的第三方检测机构为社会各界提供专业的志贺氏菌检测服务，检测报告具有法律效力，可用于产品质量证明、贸易结算、纠纷仲裁等用途。

随着食品安全意识的不断提高和检测技术的持续发展，食品志贺氏菌检验的应用范围将进一步扩大，为食品安全保障提供更加有力的技术支撑。

常见问题

在食品志贺氏菌检验过程中，检测人员和委托方经常会遇到一些疑问。以下是对常见问题的解答：

问：志贺氏菌检验需要多长时间？

答：采用传统培养方法进行志贺氏菌检验，从样品接收到出具报告，一般需要5-7个工作日。具体时间取决于检验流程和菌株鉴定的工作量。采用PCR等快速检测方法，可在增菌后24小时内得到初步结果，但阳性结果仍需通过培养方法确认。对于有特殊时限要求的客户，可与检测机构沟通加急服务。

问：志贺氏菌检验的检出限是多少？

答：根据国家标准，志贺氏菌检验采用定性检测方法，通常以25g样品中是否检出志贺氏菌作为判定标准。即检测结果报告为"25g样品检测中心出"或"25g样品中未检出"。如果客户有定量检测需求，可采用MPN法等方法进行定量分析。

问：哪些食品容易受到志贺氏菌污染？

答：志贺氏菌主要通过粪-口途径传播，因此容易受到污染的食品包括：受污染水源灌溉的蔬菜水果、带菌者加工的即食食品、受污染的饮用水和饮料、卫生条件差的水产品等。此外，在夏秋季节，气温较高，食品储存不当更易导致志贺氏菌污染和繁殖。

问：志贺氏菌检验的样品如何采集和运输？

答：样品采集应遵循无菌操作原则，使用无菌器具采集具有代表性的样品。样品量一般不少于250g。采集后应尽快送检，运输过程中应保持适当的温度条件，冷冻食品应保持冷冻状态，冷藏食品应保持冷藏状态。样品送达实验室后应尽快检验，一般不应超过4小时。

问：志贺氏菌检验结果不合格如何处理？

答：如果检测结果为志贺氏菌阳性，表明该食品不符合食品安全标准，不得销售和食用。生产企业应对同批次产品进行追溯和召回，排查污染原因并采取纠正措施。监管部门将依法对不合格产品进行处置，并对生产企业进行相应的处理。

问：志贺氏菌检验的判定依据是什么？

答：志贺氏菌检验的判定依据包括国家标准、行业标准和产品标准等。对于预包装食品，通常依据GB 29921-2013《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》等标准进行判定。不同食品类别对志贺氏菌的限量要求可能不同，具体应参照相应产品标准执行。

问：如何预防食品受到志贺氏菌污染？

答：预防志贺氏菌污染应从多个环节入手：加强水源保护和饮用水消毒；严格执行食品从业人员健康检查制度，杜绝带菌者从事食品加工；保持良好的个人卫生习惯，饭前便后洗手；食品加工过程中做到生熟分开，防止交叉污染；食品应充分加热后食用，避免生食或半生食；加强食品储存管理，低温保存易腐食品。

问：志贺氏菌检验与其他致病菌检验有何不同？

答：志贺氏菌检验与沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7等致病菌检验在检测流程上有相似之处，都包括增菌、分离、鉴定等步骤。但不同致病菌的增菌液、分离培养基和鉴定方法各不相同。志贺氏菌增菌通常使用GN增菌液，分离使用XLD、HE等选择性培养基，鉴定需要结合生化试验和血清学试验。检验人员应根据目标菌的特性选择合适的检测方法。